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BRET

 

Il trasferimento di energia a risonanza di bioluminescenza o BRET è una tecnologia di analisi basata su cellule non invasive e avanzata, utilizzata per rilevare le interazioni proteina-proteina. BRET coinvolge tag di proteine fluorescenti e bioluminescenti con corrispondenti proprietà di emissione ed eccitazione per lo studio del trasferimento di energia di risonanza fra i tag proteici nelle loro vicinanze a causa delle loro interazioni. L'identificazione di queste interazioni proteina-proteina fornisce informazioni vitali su varie malattie e migliora i metodi di trattamento.

Il principio di funzionamento della tecnica BRET si basa sul trasferimento di energia di risonanza di Förster, che afferma che l'efficienza del trasferimento di energia fra un donatore e un accettante è inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza di separazione fra di loro. Il donatore bioluminescente di solito è il dosaggio BRET Renilla Luciferase o RLuc, che è spesso ottenuto dalla viola del mare, la Renilla reniformis. Migliora l'ossidazione del suo substrato, la celenterazina, per ottenere una luce blu. Lo spettro di emissione ottenuto sovrasta gli spettri di eccitazione della proteina fluorescente gialla o YFP.

L'impostazione di un saggio BRET per l'esame delle interazioni proteina-proteina include i seguenti passaggi: 1) Smistamento e creazione di una coppia di donatori / accettori e substrati. La creazione delle due proteine naturalmente legate alla proteina luciferasi del donatore o alla proteina fluorescente dell'accettore dipende dal tipo di BRET. 2) Progettazione e autenticazione del recettore pertinente insieme a controlli appropriati. La determinazione della proteina più adatta viene effettuata perché l'inserimento di un controllo negativo / positivo è più essenziale per finalizzare la specificità dell'interazione. 3) Classificazione del sistema cellulare e co-espressione delle due proteine leganti BRET ad un livello fisiologico di espressione pertinente. 4) Rilevazione del segnale BRET e fabbricazione di saggio appropriato. I segnali vengono misurati dalle cellule membro, dalla sospensione cellulare, dalle sezioni subcellulari, dalle proteine purificate e anche dal terreno di coltura. 5) Valutazione del segnale BRET. Il segnale BRET è il rapporto fra il segnale luminoso dell'emissione dell'accettore relativo a quello dell'emissione del donatore. Quindi il valore netto BRET viene calcolato deducendo il rapporto di background BRET dal rapporto BRET acquisito dalle cellule. La valutazione dell'accettore da parte del donatore viene effettuata dividendo la magnitudine precedente di fluorescenza per la magnitudine della luminescenza.

Esistono tre diversi derivati BRET che sono ampiamente utilizzati per scopi di laboratorio: BRET1, BRET2 e eBRET.

BRET 2 utilizza il substrato DeepBlueC, che ha straordinarie capacità di separazione delle emissioni di donatore e accettore, consentendo di differenziare facilmente le emissioni di donatore e accettore e riducendo i segnali di rumore di fondo. A causa della bassa resa quantica e del rapido decadimento del substrato, è necessario un numero elevato di cellule per raggiungere livelli elevati di luminescenza per il rilevamento di BRET. Richiede anche un apparato altamente sensibile.

eBRET ha il vantaggio di uno screening ad alta produttività e non richiede l'aggiunta frequente di substrati. eBRET deve essere eseguita solo utilizzando cellule vive a temperatura ambiente. Poiché dipende dalle esterasi endogene, non può essere coinvolta nel processo di analisi degli estratti cellulari o delle proteine purificate.

Esistono diverse applicazioni della tecnica BRET, che includono il sistema BRET per misurare le interazioni proteina-proteina dinamica nei batteri. La rilevazione delle interazioni proteina-proteina dinamica che avvengono all'interno dei batteri può essere effettuata utilizzando la tecnica BRET con luciferasi LuxAB. Questo viene fatto per acquisire informazioni sulle attività batteriche come lo sviluppo e la patogenicità. Nel processo, la eYFP, proteina gialla fluorescente potenziata, accetta l'irradiazione dai batteri LuxAB e produce fluorescenza gialla. La presenza di BRET si osserva solo quando LuxAB e eYFP sono legati alla coppia di proteine interagenti FlgM e FliA. Inoltre, l'interazione indotta da sirolimus fra FKBP12 e FRB e l'abolizione dose-dipendente dell'interazione di FK506 porta alla formazione del ligando FKBP12.

Le tecniche BRET possono essere utilizzate per spiegare la formazione di omodimeri mediante l'interazione di proteine dell'orologio biologico KaiA, KaiB e KaiC codificate da geni del ritmo circadiano (giornaliero) dei cianobatteri.
Le tecniche di imaging BRET sono ampiamente utilizzate per l'analisi delle interazioni proteiche ed in molte altre metodologie per l'illustrazione di colture batteriche, tessuti vegetali e sospensioni di cellule di mammifero. Una fotocamera EB-CCD combinata con una microimager viene utilizzata per l'imaging dei segnali BRET a livello tissutale, cellulare e subcellulare. Il processo di imaging BRET viene utilizzato per la supervisione dell'interazione proteica di COP1 nei tessuti vegetali che assorbono vari spettri di luce. L'entità quantitativa del BRET può essere ottenuta introducendo un raddrizzatore di profili di emissione RLUC-EYFP. Inoltre, l'interazione di CCAAT / enhancer binding protein a (C / EBPa) nei nuclei di cellule di mammifero separate può anche essere rilevata utilizzando la tecnica BRET.

Altre applicazioni del trasferimento di energia a risonanza bimolecolare o BRET sono: 1) Analisi GPCR-ß arrestin per monitorare l'attività del recettore accoppiato a proteine G. 2) Dimerizzazione dei recettori. 3) Rilevamento di cAMP. 4) Attivazione del recettore della tirosina chinasi. 5) Attività di chinasi. 6) Rilevamento dello ione Ca2+. 7) Test di apoptosi. 8) Attività proteasica.

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